目标獲取
從基因文庫中獲取
1、基因文庫：将含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體儲存，各個受體菌分别含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。
2、基因文庫的種類：
（1）基因組文庫；
（2）部分基因文庫。
利用PCR技術擴增目的基因
1、PCR含義：是一項在生物體外複制特定DNA片段的核糖合成技術。全稱是多聚酶鍊式反應。
2、PCR原理：DNA雙鍊複制。
3、前提條件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。
4、擴增過程：目的基因DNA受熱變性後解鍊為單鍊，引物與單鍊相應互補序列結合，在DNA聚合酶的作用下進行延伸，如此重複循環多次。
5、結果：每次循環後的目的基因的量增加一倍，即成指數形式擴增。
人工合成
如果基因較小，核苷酸序列又已知，可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。
載體構建
組成
1、目的基因；
2、啟動子；
3、終止子；
4、标記基因。
功能
1、使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代；
2、使目的基因能夠表達和發揮作用。
步驟
1、用一定的限制酶切割質粒，使之出現一個黏性末端切口。
2、用同種限制酶切割目的基因，産生相同的黏性末端。
3、将目的基因片段插入質粒切口，加入适量DNA連接酶，使目的基因與質粒形成重組質粒。
4、基因表達載體的構成：目的基因+啟動子+終止子+标記基因
目标導入
轉化
目的基因進入受體細胞内，并且在受體細胞内維持穩定和表達的過程。
受體種類
1、微生物：細菌細胞
2、植物細胞：卵細胞、受精卵、體細胞
3、動物細胞：受精卵、胚胎細胞
導入方法
1、微生物：感受态細胞法
（1）感受态細胞：指細菌細胞經過Ca2+處理後，細胞壁透性增強，能夠吸收周圍環境中DNA分子的生理狀态。
（2）過程：CaCl2處理細胞→感受态細→表達載體與感受态細胞混合→感受态細胞吸收DNA分子。
2、植物細胞：農杆菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法
（1）農杆菌：土壤微生物，易感染雙子葉植物和裸子植物；對大多數單子葉植物沒有感染力。
（2）Ti質粒的T_DNA可轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體DNA上。
（3）過程：目的基因插入T_DNA，T_DNA進入農杆菌，将農杆菌導入植物細胞。
3、動物細胞：顯微注射法
（1）目的基因表達載體經過提純備用，取得受體動物的卵（或受精卵）備用。
（2）采用顯微注射技術将目的基因表達載體注射到卵（或受精卵）中。
（3）培養液培養成為早期胚胎。
（4）将早期胚胎移植到雌性動物子宮内，發育成新個體。
檢測鑒定
檢測
1、導入檢測：檢測受體細胞染色體DNA上是否含有目的基因。
DNA分子雜交法（DNA探針法）。
2、表達檢測：檢測目的基因是否完成轉錄出mRNA。
分子雜交法檢測RNA。
1、檢測目的基因是否完成表達翻譯成蛋白質。
提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原——抗體雜交。
2、鑒定：個體生物學水平鑒定，鑒定抗性等。
