原理
概述
所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信号積累實時監測整個PCR進程，最後通過标準曲線對未知模闆進行定量分析的方法。
檢測方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鍊後，發射熒光信号，而不摻入鍊中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信号，從而保證熒光信号的增加與PCR産物的增加完全同步。
SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖
PCR産物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增産物的單一性）
2.TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發射的熒光信号被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信号，即每擴增一條DNA鍊，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信号的累積與PCR産物的形成完全同步。
技術原理
将标記有熒光素的Taqman探針與模闆DNA混合後，完成高溫變性，低溫複性，适溫延伸的熱循環，并遵守聚合酶鍊反應規律，與模闆DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素遊離于反應體系中，在特定光激發下發出熒光，随着循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的随擴增而變化熒光信号強度，求得Ct值，同時利用數個已知模闆濃度的标準品作對照，即可得出待測标本目的基因的拷貝數。
Ct值
Ct值（Cycle threshold，循環阈值）的含義為：每個反應管内的熒光信号到達設定阈值時所經曆的循環數
（如圖1所示）。
1.熒光阈值（threshold）的設定
PCR反應的前15個循環的熒光信号作為熒光本底信号，熒光阈值的缺省（默認）設置是3-15個循環的熒光信号的标準偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
2.Ct值與起始模闆的關系
每個模闆的Ct值與該模闆的起始拷貝數的對數存在線性關系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n為擴增反應的循環次數，X0為初始模闆量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信号達到阈值強度時擴增産物的量。
起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的标準品可作出标準曲線，其中橫坐标代表起始拷貝數的對數，縱坐标代Ct值。因此，隻要獲得未知樣品的Ct值，即可從标準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
熒光化學物質
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現将其原理簡述如下：
1.TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分别标記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信号被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信号，即每擴增一條DNA鍊，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信号的累積與PCR産物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平台。
2.SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鍊後，發射熒光信号，而不摻入鍊中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信号，從而保證熒光信号的增加與PCR産物的增加完全同步。SYBR僅與雙鍊DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，确定PCR反應是否特異。
3.分子信标：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發夾結構的莖環雙标記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導緻熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會産生熒光。PCR産物生成後，退火過程中，分子信标中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離産生熒光。
傳統定量PCR
1．傳統定量PCR方法簡介
1）内參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上遊引物用熒光标記，下遊引物不标記。在模闆擴增的同時，内标也被擴增。在PCR産物中，由于内标與靶模闆的長度不同，二者的擴增産物可用電泳或高效液相分離開來，分别測定其熒光強度，以内标為對照定量待檢測模闆。
2）競争法：選擇由突變克隆産生的含有一個新内切位點的外源競争性模闆。在同一反應管中，待測樣品與競争模闆用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光标記）。擴增後用内切酶消化PCR産物，競争性模闆的産物被酶解為兩個片段，而待測模闆不被酶切，可通過電泳或高效液相将兩種産物分開，分别測定熒光強度，根據已知模闆推測未知模闆的起始拷貝數。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标記引物，擴增産物被固相闆上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法隻是定性實驗，若加入内标，作出标準曲線，也可實現定量檢測目的。
2．内标在傳統定量中的作用
由于傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平台期後進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平台期時，檢測重現性極差。同一個模闆在96孔PCR儀上做96次重複實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點産物量推算出起始模闆量。加入内标後，可部分消除終産物定量所造成的不準确性。但即使如此，傳統的定量方法也都隻能算作半定量、粗略定量的方法。
3．内标對定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的内标，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模闆之間的幹擾和競争，尤其當兩種模闆的起始拷貝數相差比較大時，這種競争會表現得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合适數量的已知模闆作為内标。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入内标，但仍然隻是一種半定量的方法。
實時熒光定量PCR
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量隻能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信号的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據标準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需内标是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模闆不同時間擴增或同一時間不同管内擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模闆的線性關系由于Ct值與起始模闆的對數存在線性關系，可利用标準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外标準曲線定量的方法。
外标準曲線的定量方法相比内标法是一種準确的、值得信賴的科學方法。利用外标準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準确，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
實時熒光定量PCR的定量方法
在Real-timePCR中，模闆定量有兩種策略，相對定量和絕對定量。
相關應用
臨床疾病診斷
各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性别發育異常、智力低下綜合症、胎兒畸形等優生優育檢測；腫瘤标志物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。
動物疾病檢測
禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線杆菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢杆菌。
食品安全
食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業阪崎腸杆菌等檢測。
科學研究
醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。
應用行業
各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。
由于qPCR是實時定量檢測緻病病原體基因核酸，因此它比化學發光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優勢。
關于名稱
根據MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）的指導方針，qPCR為Quantitative real-time PCR的簡稱，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR僅用來表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR，但是有少數作者并沒有堅持這一原則。
