藍白斑篩選原理

藍白斑篩選原理

基因工程操作手段
藍白斑篩選是一種基因工程常用的細菌重組質粒的篩選方法。野生型大腸杆菌(E.Coli)産生的β-半乳糖苷酶可以将無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。有色物質可以使整個培養菌落産生顔色變化,而顔色變化是鑒定和篩選的最直觀有效的方法。
  • 中文名:藍白斑篩選原理
  • 外文名:Blue-White Selection
  • 别名:
  • 表達式:
  • 提出者:
  • 适用領域:
  • 應用學科:基因工程
  • 簡介:一種基因工程常用的重組菌篩選
  • 篩選原理:是根據載體的遺傳特征篩選重組
  • 類别:基因工程操作手段

簡介

生物科學藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法:是根據載體的遺傳特征篩選重組子,如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸杆菌的DNA的短區段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。

在這個編碼區中插入了一個多克隆位點(MCS),它并不破壞讀框,但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體适用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。

因此,宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時存在時,可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣,lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補,稱為α-互補。由α-互補而産生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時産生藍色菌落,因而易于識别。

然而,當外源DNA插入到質粒的多克隆位點後,幾乎不可避免地導緻無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接産物轉化的鈣化菌平闆37℃溫箱倒置培養12-16hr後,有重組質粒的細菌形成白色菌落。

研究

針對高校生物科學實驗教學中存在的問題,着重探究了基因重組試驗中的α-互補與藍白斑篩選機制,精心設計了5組試驗。

結果指出,經雙酶切的質粒載體自身不能環化,也不能成功轉化;藍白斑篩選中的藍斑通常來源于商品載體中的環狀質粒或者線性載體自連後的轉化産物;重組子一般為白斑,但在一定條件下,白斑也會變成藍斑。在此基礎上作了進一步的讨論,為今後的教學實踐和科學研究提供借鑒和指導。

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