基因敲除:生物学术语-中文百科频道

概述

基因敲除是将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。常用同源重组的方法。敲除的基因用以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR-Associated)是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。它是细菌和古细菌为应对噬菌体和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。此系统的工作原理是通过人工优化的具有引导作用的单链gRNA(Guide RNA)引导核酸酶Cas蛋白在与gRNA配对的靶位点处剪切双链DNA，引起DNA双链断裂（DSB），进而利用生物体内非同源末端修复机制（NHEJ）或同源重组机制（HR）修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，致使基因功能丧失。目前CRISPR/Cas9技术已经广泛应用于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、鱼类、微生物等各个领域。

常用技术

ES打靶基因敲除利用同源重组进行基因敲除

利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。

TetraOne基因敲除技术 ES打靶仅需6个月

赛业生物科技（Cyagen Biosciences）宣布推出TetraOne 基因敲除，速度上媲美TALEN、CRISPR/Cas9（把ES打靶基因敲除/敲入鼠的定制周期降低至6个月），而且避免了TALEN、CRISPR/Cas9脱靶效应困扰的革命性技术。TetraOne 基因敲除的出现，是ES打靶技术制备基因敲除鼠的一个重大突破。

利用随机插入突变进行基因敲除

大规模的随机插入突变，它为在基因组范围内敲除掉任何一个基因提供了可能。这项技术具有效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。随机插入突变可以分为T-DNA插入突变和转座子插入突变。

RNA干扰引起的基因敲除

RNA干扰（RNA interference,RNi）是一种普遍的转录后基因沉默的机制，由siRNA（small intereferenceRNA）引起，siRNA是外源基因产生的dsRNA在Dicer酶的作用下所产生的长度为21-22nt的一系列片段的总称，具有很强的关闭基因的功能，能够介导RNA干涉现象，诱导出一种由siRNA分核酸酶以及螺旋酶等结合在一起的RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencingcomp lex,R ISC）。R ISC能够解开siRNA并精确的指导特异mRNA降解。通过将dsRNA分了导入细胞内，特异性地降解细胞内与基同源的mRNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。

基本步骤

利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：

1、ES细胞的获得：现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

2、基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如neo基因，TK基因等）的载体上，此重组载体即为打靶载体。

3、将基因打靶载体通过一定的方式（常用电穿孔法）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。

4、用选择性培养基筛选已击中的细胞：一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。

5、通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

缺陷

随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。