基本介绍
染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。
ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
技术路线
实验流程
（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来；
（2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段；
（3）添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体；
（4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序；
（5）将准备好的样本进行深度测序。
生物信息分析流程
（1）将测序得到的短序列片段匹配到参考基因组序列上。
（2）有一部分短序列不能匹配到参考基因组上，有可能是未知的基因组序列；另一部分是能够匹配到基因组上的短序列，通常要对这些短序列进行复盖度计算。
（3）从匹配到基因组上的短序列中进行富集区域的扫描。通常扫描到的富集区即被认为是蛋白质与DNA相互结合的区域（也有假阳性位点等的影响）。
（4）对扫描到的富集区做深度分析，包括基因，GO注释，利用基因浏览器进行可视化浏览，研究与基因结构的关系等。
研究内容
测序
对客户提供的ChIP样品（如果有阴阳参启动子区域或DNA序列的）进行定量检测，检测合格后进行测序文库构建、DNA成簇（Cluster generation）扩增、高通量测序。
基本数据分析
数据产出统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列（Reads）长度、Reads数量、数据产量。
高级数据分析
标准高级数据分析内容包括：
（1）ChIP-Seq序列与参考序列比对；
（2）Peak calling：统计样品Peak信息（峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数）；
（3）统计样品Uniquely mapped reads在基因上、基因间区的分布情况及复盖深度；
（4）给出每个样品Peak关联基因列表及GO功能注释；
（5）在多个样品间，对与Peak关联基因做差异分析。
应用领域
由于ChIP-Seq的数据是DNA测序的结果，为研究者提供了进一步深度挖掘生物信息的资源，研究者可以在以下几方面展开研究：
（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；
（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；
（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；
（4）CTCF转录因子研究。
案例分析
ChIP-Seq案例研究
Ellen Markljung等利用ChIP-Seq技术，发现：家猪IGF2基因（编码Insulin-like growth factor 2）第三内含子单碱基G→A的替换，导致抑制因子ZBED6在该基因上结合位点的丧失，从而使IGF2在骨骼肌中上调表达（表达量是正常情况的3倍），这一突变主要影响肌肉生长（提高了骨骼肌的数量，因此猪肉产量提高了3~4%）、心脏增大和脂肪沉积。
ZBED6基因与ZBED6蛋白
ZBED6基因：是失去转座功能的转座子，在所有哺乳动物中位于ZC3H11A基因第一内含子中；该基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、马、家猪中高度保守。Real-time-PCR分析显示，小鼠Zbed6 mRNA在脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睾丸组织有不同程度地表达。
ZBED6蛋白是首次报道。ZBED6蛋白含有2个BED结构域和1个hATC二聚结构域；第61~80位和第231~248位氨基酸残基是2个细胞核定位信号（富Lys-Arg区段，KKKRKKGLRIKGKRRRKKLI）。该蛋白在哺乳动物中高度保守，尤其是DNA结合BED结构域，在26个物种中（包括家猪）显示出~100%相似性。
ZBED6蛋白作为抑制因子调控基因表达的方式
用siRNA将小鼠C2C12成肌细胞中的Zbed6基因沉默后的相关实验结果，证实了ZBED6蛋白作为抑制因子是通过与位于Igf2基因第三内含子中的QTN（Quantitative trait nucleotide）位点结合来抑制Igf2基因的表达。当Zbed6基因沉默后，Igf2基因的表达量升高、细胞增殖（肌管形成）加快、创伤愈合加快。
为了研究ZBED6蛋白作用靶点（Igf2基因及其下游基因），作者采用ChIP-Seq技术对小鼠C2C12成肌细胞进行分析。AB SOLiD测序得到：
①24million reads（比对到小鼠基因组上），2,499 Peaks；大多数峰（Peaks）集中在Igf2基因内含子中的QTN位点，即，QTN位点是ZBED6蛋白在基因组上的主要结合位点（图1）。
②GO注释分析发现，ZBED6蛋白的1200个作用靶点起着发育、转录调控、细胞分化等作用（图2）。其中，262个靶基因编码转录因子，36个含有Homeobox结构域，26个属于bHLH（basic helix-loop-helix）家族，10个属于FOX家族，8个细胞核受体，7个属于SOX家族（图3）。
综上所述，IGF2基因突变的家猪和Zbed6基因沉默的小鼠C2C12成肌细胞的表型效应、高度的序列保守、核定位、广泛的组织分布、许多靶基因有重要的生物学功能，这一系列现象说明：在哺乳动物中，ZBED6是一个重要的转录因子，影响着发育、细胞增殖和生长。
