基因敲除:生物學術語-中文百科頻道

概述

基因敲除是将細胞基因組中某基因去除或使基因失去活性的技術。去除原核生物細胞、真核生物的生殖細胞、體細胞或幹細胞基因組中的基因等。廣義的基因敲除包括某個或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因調控序列的敲除以及成段基因組序列的敲除。常用同源重組的方法。敲除的基因用以觀察生物或細胞的表型變化，是研究基因功能的重要手段。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR-Associated)是一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。它是細菌和古細菌為應對噬菌體和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防禦機制。此系統的工作原理是通過人工優化的具有引導作用的單鍊gRNA(Guide RNA)引導核酸酶Cas蛋白在與gRNA配對的靶位點處剪切雙鍊DNA，引起DNA雙鍊斷裂（DSB），進而利用生物體内非同源末端修複機制（NHEJ）或同源重組機制（HR）修複DNA，導緻基因移碼突變、替換或删除，緻使基因功能喪失。目前CRISPR/Cas9技術已經廣泛應用于哺乳動物、植物、鳥類、昆蟲、魚類、微生物等各個領域。

常用技術

ES打靶基因敲除利用同源重組進行基因敲除

利用DNA轉化技術，将含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導入靶細胞，通過載體與靶細胞染色體上同源序列間的重組，将外源基因整合入内源基因組内，使外源基因得以表達。

TetraOne基因敲除技術 ES打靶僅需6個月

賽業生物科技（Cyagen Biosciences）宣布推出TetraOne 基因敲除，速度上媲美TALEN、CRISPR/Cas9（把ES打靶基因敲除/敲入鼠的定制周期降低至6個月），而且避免了TALEN、CRISPR/Cas9脫靶效應困擾的革命性技術。TetraOne 基因敲除的出現，是ES打靶技術制備基因敲除鼠的一個重大突破。

利用随機插入突變進行基因敲除

大規模的随機插入突變，它為在基因組範圍内敲除掉任何一個基因提供了可能。這項技術具有效率高、基因完全失活、容易分離鑒定被插入引起失活的目的基因等優點。随機插入突變可以分為T-DNA插入突變和轉座子插入突變。

RNA幹擾引起的基因敲除

RNA幹擾（RNA interference,RNi）是一種普遍的轉錄後基因沉默的機制，由siRNA（small intereferenceRNA）引起，siRNA是外源基因産生的dsRNA在Dicer酶的作用下所産生的長度為21-22nt的一系列片段的總稱，具有很強的關閉基因的功能，能夠介導RNA幹涉現象，誘導出一種由siRNA分核酸酶以及螺旋酶等結合在一起的RNA誘導沉默複合物（RNA-induced silencingcomp lex,R ISC）。R ISC能夠解開siRNA并精确的指導特異mRNA降解。通過将dsRNA分了導入細胞内，特異性地降解細胞内與基同源的mRNA，封閉内源性基因的表達來失活該基因同樣可以實現基因的敲除。

基本步驟

利用基因打靶技術産生轉基因動物的程序一般為：

1、ES細胞的獲得：現在基因敲除一般應用于鼠，而最常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。

2、基因載體的構建：把目的基因和與細胞内靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有标記基因（如neo基因，TK基因等）的載體上，此重組載體即為打靶載體。

3、将基因打靶載體通過一定的方式（常用電穿孔法）導入同源的胚胎幹細胞（EScell）中，使外源DNA與胚胎幹細胞基因組中相應部分發生同源重組，将打靶載體中的DNA序列整合到内源基因組中從而得以表達。

4、用選擇性培養基篩選已擊中的細胞：一般地，篩選使用正、負選擇法，比如用G418篩選所有能表達neo基因的細胞，然後用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表達的細胞，剩下的細胞為命中的細胞。将篩選出來的靶細胞導入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠體内，使其發育成嵌合體小鼠。

5、通過觀察嵌和體小鼠的生物學形狀的變化進而了解目的基因變化前後對小鼠的生物學形狀的改變，達到研究目的基因的目的。

缺陷

随着基因敲除技術的發展，早期技術中的許多不足和缺陷都已經解決，但基因敲除技術始終存在着一個難以克服的缺點，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：一方面，許多基因在功能上是冗餘的，敲掉一個在功能上冗餘的基因，并不能造成容易識别的表型，因為基因家族的其他成員可以提供同樣的功能；另一方面對于某些必需基因，敲除後會造成細胞的緻死性，也就無法對這些必需基因進行相應的研究了。