簡介
一些載體（如PUC系列質粒）帶有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的編碼區，該編碼區中含有多克隆位點（MCS），可用于構建重組子。
這種載體适用于僅編碼β-半乳糖苷酶C端ω片段的突變宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有半乳糖苷酶活性，但它們同時存在時，α片段與ω片段可通過α-互補形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補。n
由α-互補而産生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在時産生藍色菌落。而當外源DNA插入到質粒的多克隆位點後，幾乎不可避免地破壞α片段的編碼，使得帶有重組質粒的LacZ-細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，稱為藍白斑篩選。
藍白斑篩選中的藍斑通常來源于商品載體中的環狀質粒或者線性載體自連後的轉化産物;重組子一般為白斑,但在一定條件下,白斑也會變成藍斑。
白斑篩選
大腸杆菌β-半乳糖苷酶可分成2部分即α肽段（N-端的146個aa）和C-段。α肽段的基因位于載體上并含有不影響其ORF（open reading）的多克隆位點（MCS），而C-段的基因位于工程菌E.coli DH5α上。二者在同一菌株中表達時，菌株中的C-段與載體上的α肽段互補而具有酶活性，能将無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。
在MCS上插入新基因将會改變其ORF而使得載體上的α肽段不能與菌株中的C-段互補而不能無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍産生白斑。選擇轉入的陽性克隆即選擇白斑。
載體的選擇
設計适用于藍白斑篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主菌的染色體基因組中編碼β-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的β-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短肽（即α肽鍊），從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal産生藍色物質。用于藍白斑篩選的載體具有一段稱為lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的啟動子；編碼α肽鍊的區段；一個多克隆位點(MCS)。
MCS位于編碼α肽鍊的區段中，是外源DNA的選擇性插入位點，但其本身不影響載體編碼α肽鍊的功能活性。雖然上述缺陷株基因組無法單獨編碼有活性的β-半乳糖苷酶，但當菌體中含有帶lacz'的質粒後，質粒lacz'基因編碼的α肽鍊和菌株基因組表達的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補，具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍色物質的能力，這種現象即α-互補。
操作中，添加IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平闆培養基中菌落呈現藍色。以上是攜帶空載體的菌株産生的表型。當外源DNA（即目的片段）與含lacz'的載體連接時，會插入進MCS，使α肽鍊讀碼框破壞，這種重組質粒不再表達α肽鍊，将它導入宿主缺陷菌株則無α互補作用，不産生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養基中的X-gal産生藍色，培養表型即呈現白色菌落。
實驗中，通常藍白篩選是與抗性篩選一同使用的。含X-gal的平闆培養基中同時含有一種或多種載體所攜帶抗性相對應的抗生素，這樣，一次篩選可以判斷出：未轉化的菌不具有抗性，不生長；轉化了空載體，即未重組質粒的菌，長成藍色菌落；轉化了重組質粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。
構建重組子
⑴、受體細胞
轉化的受體細胞一般是限制-修飾系統缺陷的突變株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突變株，它可容忍外源DNA分子進入體内并穩定地遺傳給後代。
另外還應根據載體的性質及實驗的目的選擇合适的宿主。
此外，受體細胞生長狀态和密度也很重要。不要使用經過多次轉接或儲存于4℃的培養菌。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，密度過高或不足均會影響轉化率。
⑵、載體DNA和重組DNA方面
載體本身性質決定了轉化的高低，不同的載體DNA轉化同一受體細胞，其轉化效率不同。載體的空間構象也有明顯影響，超螺旋結構的載體質粒往往有較高的轉化率，經體外酶切連接操作後的載體DNA或重組DNA由于空間上難以恢複，其轉化率常比cccDNA低兩個數量級。對以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低。
⑶、操作方面
感受态細胞的制備對轉化率影響較大。一般未經特殊處理的培養細胞對重組DNA分子不敏感，難以轉化成功。為防止雜菌和雜DNA的污染，整個操作均應在無菌條件下進行，所有器皿最好是新的，并經高壓滅菌處理，所有試劑也都要滅菌處理。
⑷、轉化體系中重組DNA的濃度與純度
轉化體系中重組DNA的濃度與純度對轉化率也有一定影響。在一定濃度範圍内，濃度越高，轉化率越高，重組DNA純度越高，轉化率越高。
⑸、外源基因與宿主染色體的同源性
外源基因來源與宿主親緣關系越近，越易整合到宿主染色體中，轉化率越高，否則易被宿主核酸酶降解而降低轉化率。
實驗設計
實驗試劑
X-gal：2%母液（用二甲基甲酰胺配制，包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞，-20℃保存備用），工作濃度20ul/20ml平闆；
氨苄青黴素(Amp)：用無菌水配制成100mg/ml母液，置-20℃冰箱保存。工作濃度100ug/ml；
IPTG：母液100mmol/L，-20℃冰箱保存。工作濃度40ul/20ml平闆；
LB液體培養基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，用NaOH調pH到7.2，121℃滅菌20min備用。固體LB培養基則在LB液體培養基中添加1.5%～2%瓊脂，滅菌後備用；
含Amp的LB固體培養基：将配好的LB固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右，加入Amp儲存液，使終濃度為100ug/ml，搖勻後鋪闆；
大腸杆菌DH5a。
試劑的作用
X-gal（5-溴-4-錄-3-吲哚-β-半乳糖苷）：一種人工化學合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷酶水解産生蘭色化合物。
IPTG：異丙基硫代半乳糖苷，很強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩定，它可誘導LacZ的表達。
實驗器具
超淨工作台；恒溫水浴鍋；制冰機；微量移液器；恒溫搖床；常溫離心機；恒溫生化培養箱；冰箱；培養皿；玻璃刮鏟。
實驗步驟
⑴、取4ul連接産物加入50ul感受态細胞中，用槍輕輕吹打均勻，冰浴30min。
⑵、将管置于水浴鍋中42℃水浴熱激90sec，立刻放置冰上2min。
⑶、加入1ml 37℃預熱的不含任何抗生素的LB培養基，混勻。
⑷、将管置于恒溫搖床上37℃振蕩培養1h。
⑸、将管置于離心機中3000rpm離心5min。
⑹、棄900ul上清，餘下約100ul上清，用槍輕輕吹勻，用于塗闆。
⑺、在一含氨苄青黴素的LB平闆上，加入20μl 20mg/ml X-gal和40μl100mmol/L IPTG。
⑻、将玻璃刮鏟過火滅菌後伸入培養平闆中，待其冷卻後均勻塗布平闆，玻璃刮鏟過火滅菌後置于酒精中備用，平闆于室溫放置30min備用。
⑼、将前述所得含重組子的菌液吸至制備好的含X-gal的平闆上，用玻璃刮鏟均勻塗布。将平闆置于生化培養箱中正面放置30min後，再倒置，于37℃培養過夜。
注意事項
1、質粒的質量和濃度
用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定範圍内成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受态細胞體積的10%。
2、防止雜菌和雜DNA的污染
整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入，為以後的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。
3、顯色反應的時間
需要将平闆放入4℃冰箱中3-4h，使得顯色反應充分。
4、平闆的塗布
菌液塗平闆的時候要避免來回塗布，否則過多的機械擠壓塗布會導緻細胞破裂，影響轉化效率。
