PCR:生物學的聚合酶鍊反應-中文百科頻道

PCR的創建及發展

Khorana (1971)等最早提出核酸體外擴增的設想：“經DNA變性，與合适的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重複該過程便可合成tRNA基因。”

但由于當時基因序列分析方法尚未成熟，熱穩定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實際意義。加上分子克隆技術的出現提供了一種克隆和擴增基因的途徑，所以Khorana的設想被人們遺忘了。

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模闆DNA而煩惱。

1983年4月的一個星期五晚上，他開車去鄉下别墅的路上,猛然閃現出“多聚酶鍊式反應”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素标記法看到了10個循環後的49 bp長度的第一個PCR片段；

1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準（專利号4,683,202 ），Mullis是第一發明人；

1985年12月20日在Science雜志上發表了第一篇PCR的學術論文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學習PCR的方法。

2016年7月7日，中科院上海生科院生化與細胞所洪國藩院士經過長期DNA基礎理論的潛心研究，成功研發出了低溫封閉多級PCR（Lcn-PCR）技術，克服了普通PCR技術的自身缺陷，同時具有超高的靈敏度和準确性，并能排除環境的交叉污染。洪國藩研究組曆時10多年利用該項技術對數千病例的病原體感染進行了臨床平行對照檢測與研究，充分證實了該項技術的可行性與精确性，而且實驗方法安全、簡便，省去了超潔淨空間所需的設備，可在普通醫院中應用。

PCR原理

DNA的半保留複制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鍊DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鍊，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則複制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鍊，當溫度降低後又可以複性成為雙鍊。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和複性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外複制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對于PCR的應用有裡程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。

PCR技術的基本原理類似于DNA的天然複制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：①模闆DNA的變性：模闆DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模闆DNA雙鍊或經PCR擴增形成的雙鍊DNA解離，使之成為單鍊，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模闆DNA與引物的退火（複性）：模闆DNA經加熱變性成單鍊後，溫度降至55℃左右，引物與模闆DNA單鍊的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模闆-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模闆，按堿基互補配對與半保留複制原理，合成一條新的與模闆DNA鍊互補的半保留複制鍊，重複循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留複制鍊”，而且這種新鍊又可成為下次循環的模闆。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能将待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

循環參數

預變性

模闆DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

變性步驟

循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。

引物退火

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度适當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

引物延伸

引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最适溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間随擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

循環數

大多數PCR含25-35循環，過多易産生非特異擴增。

最後延伸

在最後一個循環後，反應在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，并使單鍊産物退火成雙鍊。

步驟

标準的PCR過程分為三步：t

DNA變性：（90℃-96℃）：雙鍊DNA模闆在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鍊DNA。t

退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模闆結合，形成局部雙鍊。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模闆互補的DNA鍊。t t

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間内複制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。t

檢測

PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

反應特點

特異性強

PCR反應的特異性決定因素為：

①引物與模闆DNA特異正确的結合；

②堿基配對原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模闆的正确結合是關鍵。引物與模闆的結合及引物鍊的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模闆與引物的結合（複性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

靈敏度高

PCR産物的生成量是以指數方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量級的起始待測模闆擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

簡便、快速

PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地将反應液加好後，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增産物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模闆。可直接用臨床标本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

常見問題

PCR産物的電泳檢測時間一般為48h以内，有些最好于當日電泳檢測，大于48h後帶型不規則甚至消失。

假陰性

不出現擴增條帶。PCR反應的關鍵環節有①模闆核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及溴乙錠的使用， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模闆：①模闆中含有雜蛋白質，②模闆中含有Taq酶抑制劑，③模闆中蛋白質沒有消化除淨，特别是染色體中的組蛋白，④在提取制備模闆時丢失過多，或吸入酚。⑤模闆核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是标本的消化處理，模闆核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜随意更改。

陰性

需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批号的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一緻，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導緻引物變質

降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增産量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可緻非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模闆的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用标準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋内的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模闆特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模闆失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一緻，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合适：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR産物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增産物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導緻假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止将靶序列吸入加樣槍内或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加标本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補後，可擴增出PCR産物，而導緻假陽性的産生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶：

PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一緻，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，适當增加模闆量，減少循環次數。适當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現片狀拖帶或塗抹帶：

PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。适當降低Mg2+濃度。增加模闆量，減少循環次數。

臨床應用

用于治療感染性疾病，腫瘤及遺傳病。

感染性疾病

PCR在醫學檢驗學中最有價值的應用領域就是對感染性疾病的診斷。理論上，隻要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。一般實驗室也能檢出10~100基因拷貝，而目前病原體抗原檢測方法一般需要105-7個病原體才可檢測到。PCR對病原體的檢測解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隐性或亞臨床狀态。

定量PCR研究資料已表明，病原體數量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關性。許多研究表明，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染後，潛伏期長短和臨床症狀輕重與血液中的病毒量顯著相關；也有研究表明，HIV病毒載量低于一定值時，沒有傳染性。

在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發現，病毒的數量與某些藥物的療效相關。例如，幹擾素治療對肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有顯著降低病毒高拷貝的作用。