第二代DNA測序技術:下一代測序技術-中文百科頻道

背景

DNA測序技術

長期以來，DNA測序技術一直是分子生物學相關研究中最常用的技術手段之一，從一定程度上推動了該領域的快速發展。人類基因組計劃、轉錄組分析、微生物基因組重測序、單核苷酸的多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNP) 分析等方面也促進了其他生物學領域的研究和發展。每一代測序技術的更替都标志着生物學中基因芯片、數據分析、表面化學、生物工程等技術領域有了新的突破，從而應用在了測序領域，大大降低了測序成本，提高了測序效率，使測序向着高通量、低成本、高安全性和商業化的方向發展。

第一代DNA測序

盡管第一代 DNA 測序技術以其可達 1000 bp 的測序讀長、99.999% 的高準确性幫助人們完成了大量的測序工作，但其測試速度慢、成本高、通量低等方面的不足，也緻使其不能得到大衆化的應用。随着科學技術的進步以及科研人員對測序技術的努力開發，2005 年 Roche 公司發布的 454 測序系統标志着測序技術跨人高通量并行測序的時代。第二代 DNA 測序技術又稱大量并行測序技術 (massive parallel sequencing,MPS)、高通量測序技術(high—throughput sequencing,HTS)，以低成本、99% 以上的準确度，1次可對幾百、幾千個樣本的幾十萬至幾百萬條 DNA 分子同時進行快速測序分析。這一時期的代表技術有 Roche 公司的 454、Illumina公司的 Solexa、ABI公司的SOLID，由于該時期的測序技術十分前沿，因而市場主要被這三家公司所壟斷。

基本平台

454焦磷酸法平台

454焦磷酸法平台是最早上市的循環微陣列法平台，使用的是邊合成邊測序 (sequencing by synthesis, SBS)技術，避免了Sanger法存在的宿主菌克隆問題。

①首先将待測的目的DNA分子打斷成 300-800 bp 的片段，然後在 DNA 片段的 5′ 端加上一個磷酸基團，3′ 變成平端，在兩端分别加上 44 bp 的 A、B 兩個銜接子，組成目的 DNA 的樣品文庫。加上這樣兩個銜接子 A、B 的目的是為了其在生物素和鍊黴親和素的作用下，同含有過量鍊黴親和素的磁珠特異性結合。

②目的 DNA 片段固定到一個磁珠上之後，将磁珠包被在單個油水混合小滴(乳滴)，在這個乳滴裡進行獨立的擴增，而沒有其他的競争性或者污染性序列的影響，從而實現了所有目的 DNA 片段進行平行擴增乳滴 PCR (emul-sion PCR, emPCR)，經過富集之後，每個磁珠上都有約 107 個克隆的 DNA 片段。

③随後将這些DNA片段放入 PTP(Pico TiterPlate) 反應闆中進行後繼測序。PTP平闆含有 160 多萬個由光纖組成的孔，孔中載有化學發光反應所需的各種酶和底物。

④測序開始時，放置在四個單獨的試劑瓶裡的四種堿基，依照 T、A、C、G 的順序依次循環進入 PTP 闆，每次隻進入一個堿基。如果發生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸鹽 (inorganic pyrophosphate, PPi) 分子。PPi 在ATP硫酸化酶的催化下與腺苷酰硫酸反應生成 ATP，ATP 與蟲螢光素反應發光，光信号的最大波長約為 560 nm 。

⑤此反應釋放出的光信号實時被儀器配置的高靈敏度 CCD 捕獲到。有一個堿基和測序模闆進行配對，就會捕獲到一分子的光信号，由此一一對應，就可以準确、快速地确定待測模闆的堿基序列，讀長可達到近 500 bp 。

Solexa分析儀

Solexa 分析儀通常也被稱為 Illumina 測序儀，所使用的方法是克隆單分子陣列技術。

①将目的DNA分子打斷成 100-200 bp 的片段，随機連接到固相基質上，經過 Bst 聚合酶延伸和甲酸胺變性的橋PCR循環，生成大量的 DNA簇 (DNA cluster)，每個DNA 簇中約有1000個相同序列的 DNA 片段。

②之後的反應與Sanger法類似，加入用4種不同熒光标記并結合了可逆終止劑的 dNTP。固相基質上每個孔有八道獨立檢測的位點，所以一次可以并行八個獨立文庫，可容納數百萬的模版克隆，可把多個樣品混合在一起檢測，每個固相基質上一次可讀取10億個堿基。

③DNA 簇與單鍊擴增産物的通用序列雜交，由于終止劑的作用，DNA 聚合酶每次循環隻延伸一個 dNTP。每次延伸所産生的光信号被标準的微陣列光學檢測系統分析測序，下一次循環中把終止劑和熒光标記基團裂解掉，然後繼續延伸 dNTP，實現了邊合成邊測序技術。

④其主要的缺點是由于光信号衰減和移相的原因使得序列讀長較短，可以進行每個 DNA 測序片段的閱讀長度僅為 75 bp 的末端雙向測序反應。

SOLiD測序儀

SOLiD(sequencing by oligonucleotideligationand detection, SOLiD)測序技術最初是由哈佛大學 Church 研究小組成員Shendure等所發明的。Church 研究組發明的方法的一部分授權給了 Agen-court 公司，并在 2006年7月被美國應用生物系統公司 (Applied Biosystems lnc, ABI) 收購，組建 SOLiD 測序平台。基于該原理的最新測序平台是于2010年末推出的5500xl，已是第五代産品。

①首先制備 DNA 文庫。SOLiD 技術支持兩種測序文庫，分别是片段文庫(fragment library)和配對末端文庫(mate-paired library)。将待測的DNA分子打斷，并在兩端加上接頭，則可組成片段文庫。而配對末端文庫則是先把DNA分子打斷，在中間加入 EcoP15 酶切位點和internal接頭後進行環化，然後用 EcoP15 酶切，使得接頭的兩端各有27 bp的堿基，最後在兩端加上接頭，構成文庫，适用于全基因組測序、SNP分析、結構重排及拷貝數的分析等相關領域。

②第二個階段與454焦磷酸測序法相同，加入磁珠等反應元件進行 emPCR 平行擴增，不同的是該方法的磁珠隻有1 µm。在連接測序中，底物是 8 個堿基的八聚體單鍊熒光探針，在5′末端分别标記了CY5、Teaxs Red、CY3、6-FAM這四種顔色的熒光染料。3′ 端的第 1、2 位堿基類别排序分别對應着一個固定的熒光染料，第 3、4、5 位堿基“n”是随機堿基，第 6、7、8 位堿基“z”是可以和任何堿基配對的特殊堿基。

③一次測序中包括了五輪連接反應。每輪連接反應首先是由3個堿基“n”介導，将八聚體連接在引物上，測序儀記錄熒光染料信号，然後斷裂掉堿基“z”，準備連接下一個八聚體。一次循環後，将引物重置，進行第二輪連接反應，反應位置比前一輪錯開一位，這樣引物上的每個堿基都會有兩次與第1、2位的相連接，顯著減小了測序誤差。